ISOLATION AND GENOTYPING OF Toxoplasma gondii IN SERONEGATIVE URBAN RATS AND PRESENCE OF ANTIBODIES IN COMMUNICATING DOGS IN BRAZIL.

The role of rodents in the epidemiology of toxoplasmosis was investigated in Londrina, Paraná State, Brazil. One hundred and eighty-one Rattus rattus and one Mus musculus were caught in 37 places. Blood and tissues were collected and submitted to the indirect fluorescence antibody test (IFAT) and the bioassay. Serum samples from 61 contacting dogs were also collected. Sixteen rats (8.8%) were positive for Toxoplasma gondii, but just two of them were positive by serology and bioassay test. Antibodies were found in nine (4.9%) rats. Tissues of nine rats bioassayed were positive and four isolates were obtained. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis was performed using 12 markers (SAG1, SAG2, SAG2-alt, C22-8, C29-2, L358, PK1, BTUB, GRA6, SAG3, Apico, CS3). Genotyping revealed that the four strains isolated from this study have been isolated before in cats and chickens from Brazil. None of the isolates was identified like clonal archetypal T-types I, II, and III. The rats presented lower serologic Toxoplasma gondii prevalence (8.8%) compared to contacting dogs (70.5%).

Soroprevalência da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) canina e fauna de Flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) em Bela Vista do Paraíso, Paraná / Seroprevalence of Cutaneous Leishmaniasis (LC) in dogs and identification of vectors (Diptera: Psychodidae) in Bela Vista do Paraíso, Parana state

O trabalho teve como objetivo determinar a soroprevalência da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) canina no município de Bela Vista do Paraíso, Paraná, comparar as técnicas de imunofluorescência indireta (IFI) e ensaio imunoenzimático (ELISA) e identificar as espécies de flebotomíneos presentes, possivelmente envolvidas no ciclo do parasito. Amostras de sangue de 489 cães foram submetidas à pesquisa de anticorpos anti-Leishmania sp. pela IFI e ELISA. Foram consideradas positivas as amostras que apresentaram título ≥ 40 na IFI e densidade ótica ≥ 0.174 no ELISA. Entre as amostras analisadas, 222 (45,4%) foram reagentes pela IFI e 189 (38,7%) pelo ELISA. Comparando-se os testes foram encontradas 176 amostras positivas (36,0%) e 254 negativas (51,9%) para ambas as técnicas. A sensibilidade do ELISA foi de 79,3% e a especificidade foi de 95,1%. O coeficiente global do teste foi de 87,0% com coeficiente Kappa de 0,75. A análise das variáveis para cães com sorologia positiva pela IFI demonstrou diferença significativa em relação à ausência de matas e ausência de convívio com outras espécies animais. Em cães sororeagentes pelo ELISA as variáveis que apresentaram diferença significativa foram o tipo de mata ciliar existente no ambiente, a ausência de lixo, o esgoto a céu aberto e lançado diretamente em rios ou córregos e do lixo lançado em terreno baldio, queimado ou enterrado. O resultado obtido com a captura dos flebotomíneos foi a predominância do Lutzomyia whitmani com 79,9% das espécies coletadas. Os resultados demonstraram que a LTA está amplamente disseminada na população canina do município de Bela Vista do Paraíso, e que tanto a IFI como o ELISA podem ser utilizados para o diagnóstico. Deste modo o cão apresenta-se como um elo entre o ciclo silvestre e o peridomiciliar da LTA, podendo tornar-se um sinalizador do agente no ecossistema da doença nesse ecossistema.

The aim of this study was to determine the seroprevalence of Cutaneous Leishmaniasis (CL) in dogs of Bela Vista do Paraiso, Parana state, compare the IFA and ELISA techniques and identify the vectors possibly involved in the cycle of the parasite. Were collected blood samples from 489 dogs that were subjected to detection of anti-Leishmania sp. by IFA and by ELISA. Were considered positive samples ≥40 titers in IFA and for ELISA ≥ 0.174 optical density. Among the samples analyzed, 222 (45.4%) were positive by IFA and 189 (38.7%) by ELISA. Comparing the tests were found 176 positive samples (36.0%) and 254 negative (51.9%) for both techniques. The sensitivity of ELISA was 79.3% and specificity was 95.1%. The global coefficient of the test was 87.0% with kappa coefficient of 0.75. Analysis of variables for dogs with positive serology by IFA showed significant differences regarding the absence of forests and lack of contact with other animal species. Positive sera by ELISA in dogs variables that showed significant differences were the type of riparian vegetation existing in the environment, the lack of garbage, open sewers and released directly into rivers or streams and garbage thrown on wasteland, burned or buried. The result obtained with the capture of sandflies was the predominance of Lutzomyia whitmani with 79.9% of the species collected. The result obtained with the capture of sandflies was the predominance of Lutzomyia whitmani with 79.9% of the species collected. The results showed that the LTA is widespread in the canine population of Bela Vista do Paraiso, and both the IFI and ELISA can be used for diagnosis. So the dog appears as a link between wild and peridomestic cycle of CL may become an amplifier of disease in this ecosystem.

Induced immune response of Escherichia coli BL21 expressing recombinant MSP1a and MSP1b proteins of Anaplasma marginale

This work aims to evaluate the potential of immunization with E. coli BL21 expressing the recombinant rMSP1a and rMSP1b proteins of Anaplasma marginale. E. coli BL21 was transformed with recombinant plasmids pET102/msp1α and pET101/msp1β, and rMSP1a and rMSP1b were expressed after induction by IPTG. BALB/c mice were vaccinated with formolized BL21/rMSP1a and BL21/rMSP1b, and the production in mice sera of whole IgG was determined by ELISA. The mice immunized with BL21/rMSP1a showed a better humoral response for whole IgG when compared to the mice immunized with BL21/rMSP1b; these mice exhibited a small response after the second vaccination. Sera of mice immunized with BL21/rMSP1a reacted via western blot with BL21 and rMSP1a, with molecular masses varying from 70 to 105 kDa. Sera of mice immunized with BL21/rMSP1b reacted with BL21 and rMSP1b with a molecular mass of 100 kDa. These results demonstrate that BL21 containing rMSP1a and rMSP1b in the outer membrane were able to produce an immune response in mice, reinforcing its use in vaccine models against bovine anaplasmosis.

Esse trabalho avaliou o potencial de imunização de Escherichia coli BL21 expressando as proteínas recombinantes rMSP1a e rMSP1b de Anaplasma marginale. A E. coli BL21 foi transformada com os plasmídios recombinantes pET102/msp1α e pET101/msp1β e as proteínas rMSP1a e rMSP1b foram expressas após indução com IPTG. Camundongos BALB/c foram vacinados com BL21/rMSP1a e BL21/rMSP1b formolisadas, e a produção de IgG total foi determinada pelo teste de ELISA nos soros dos camundongos imunizados. Os camundongos imunizados com a BL21/rMSP1a mostraram uma melhor resposta humoral para IgG total, comparada à resposta apresentada pelos camundongos imunizados com BL21/rMSP1b; estes camundongos exibiram uma menor resposta após a segunda vacinação. Soros de camundongos imunizados BL21/rMSP1a reagiram pelo western blot com BL21 e rMSP1a, com massa molecular variando de 70 a 105 kDa. Soro de camundongos imunizados com BL21/rMSP1b reagiram com BL21 e rMSP1b com massa molecular de 100 kDa. Esses resultados demonstram que BL21 contendo rMSP1a e rMSP1b na membrana externa foram capazes de produzir resposta imune em camundongos, reforçando o seu uso em modelos de vacina contra a anaplasmose bovina.

[Seroprevalence of Anaplasma marginale in cattle from Center-South Region of Paraná State, Brazil by a competitive ELISA test with recombinant MSP5-PR1 protein]. / Soroprevalência de Anaplasma marginale em bovinos da região Centro-Sul do estado do Paraná, Brasil, por um teste imunoenzimático competitivo utilizando proteína recombinante MSP5-PR1.

Anaplasma marginale prevalence was determined in 223 sera samples in 2-year old or older cattle, from the Center-Southern Region of the Paraná State, including Ponta Grossa, Guarapuava and Laranjeiras do Sul municipalities. A survey of antibodies IgG class against Anaplasma marginale was performed through a competitive immune absorbent assay (cELISA-PR1). From the 223 sera examined, 130 (58.74%) reacted to cELISA-PR1 test, suggesting an region of enzootic instability, with a significant percentage of animals susceptible to infection by A. marginale and potentially in risk to develop anaplasmosis. The kind of exploration in the property, the breeding and handling system, the presence of other animals (ovine/caprine, horses, wild animals), and means of commercialization of animals were analyzed. The statistical analysis showed that there were no significant differences among the analyzed variables.

Soroprevalência de Anaplasma marginale em bovinos da região Centro-Sul do estado do Paraná, Brasil, por um teste imunoenzimático competitivo utilizando proteína recombinante MSP5-PR1 / Seroprevalence of Anaplasma marginale in cattle from Center-South Region of Paraná State, Brazil by a competitive ELISA test with recombinant MSP5-PR1 protein

Foi determinada a prevalência de Anaplasma marginale em 223 soros de bovinos com idade maior ou igual a dois anos, das regiões de Ponta Grossa, Guarapuava e Laranjeiras do Sul, região Centro-Sul do estado do Paraná. O teste imunoenzimático de competição PR1 (cELISA-PR1) foi utilizado para determinar a presença ou ausência de anticorpos anti-A. marginale. Dos 223 soros analisados, 130 (58,74 por cento) foram positivos pelo cELISA-PR1, sugerindo ser essa região de instabilidade de enzoótica, com uma porcentagem significativa de animais susceptíveis à infecção por A. marginale, com risco potencial para desenvolver a anaplasmose. As características de tipo de exploração da propriedade, sistema de criação, manejo e forma de comercialização dos animais foram avaliadas. A análise estatística não demonstrou haver diferença significativa entre as variáveis estudadas e a positividade dos animais.

Anaplasma marginale prevalence was determined in 223 sera samples in 2-year old or older cattle, from the Center- Southern Region of the Paraná State, including Ponta Grossa, Guarapuava and Laranjeiras do Sul municipalities. A survey of antibodies IgG class against Anaplasma marginale was performed through a competitive immune absorbent assay (cELISA-PR1). From the 223 sera examined, 130 (58.74 percent) reacted to cELISA-PR1 test, suggesting an region of enzootic instability, with a significant percentage of animals susceptible to infection by A. marginale and potentially in risk to develop anaplasmosis. The kind of exploration in the property, the breeding and handling system, the presence of other animals (ovine/caprine, horses, wild animals), and means of commercialization of animals were analyzed. The statistical analysis showed that there were no significant differences among the analyzed variables.

Comparação dos testes sorológicos de Imunofluorescência Indireta, Conglutinação Rápida, ELISA indireto e ELISA por competição para a detecção de anticorpos contra o Anaplasma marginale em soros de bovinos de diferentes áreas enzoóticas / Comparison of the serologic tests of Indirect Immunofluorescence,Rapid Conglutination, Indirect ELISA and Competition ELISA fordetection of antibodies against Anaplasma marginale in cattle sera fromdifferent enzootic areas

Os Testes Sorológicos de Conglutinação Rápida (TCR) Imunofluorescência Indireta (IFI) e Imunoenzimáticos Indireto (iELISA) utilizando ELISA por competição (cELISA), como padrão ouro, foram avaliados comparativamente para a detecção de anticorpos contra o Anaplasma marginale. Foram utilizadas 453 amostras de soros sangüíneos de bovinos vacinados e não-vacinados e de áreas de estabilidade e instabilidade enzoótica. O iELISA, IFI e TCR apresentaram respectivamente, índice kappa=0,77 (substancial), 0,57 e 0,49 (moderado), sensibilidade de 90,6, 90,2 e 73,7 e especificidade de 86,6, 62,8, e 79,3. O iELISA apresentou o melhor desempenho e maior especificidade, podendo ser indicado na avaliação do perfil sorológico de rebanhos, na detecção de animais persistentemente infectados e de animais submetidos a programas de vacinação. As técnicas de IFI e TCR, mesmo apresentando desempenho inferior, podem ser recomendadas para a realização de inquéritos epidemiológicos e para o monitoramento de animais em trânsito entre as diferentes regiões geográficas

The serological techniques Rapid Conglutination Test (RCT), Indirect ELISA (iELISA) and IndirectImmunofluorescent Assay (IFA), using the competition ELISA (cELISA) as gold test, were comparativelyevaluated to detect antibodies against Anaplasma marginale. A total of 453 sera from vaccinated andnon vaccinated cattle and, collected from enzootic stability and instability areas were tested. iELISA, IFAand TCR presented kappa index = 0.77 (substantial); 0.57 and 0.49 (moderate), sensibility of 90.6%;90.2% and 73.7% and specificity of 86.6%; 62.8%, and 79.3%, respectively. Therefore, iELISA presentedbetter specificity than IFA and RCT, and can be indicated for more detailed serological investigations,detection of persistently infected animals in cattle herds and for monitorating of vaccination programs.IFA and TCR can be used in prevalence studies and to monitor cattle movement between differentgeographical regions

Partial protection against tissue cysts formation in pigs vaccinated with crude rhoptry proteins of Toxoplasma gondii.

A vaccine containing crude Toxoplasma gondii rhoptry proteins incorporated in the immunostimulating complexes (ISCOM) adjuvant was tested in pigs for protecting against tissue cyst formation. For this, 38 mixed breed pigs were divided into four groups, G1 (vaccinated challenged, n=10) received two doses (100 microg/dose) of the rhoptry vaccine at days 0 and 21, G2 (vaccinated challenged, n=10) received viable tachyzoites (7 x 10(7)) of the RH strain at day 0, G3 (unvaccinated challenged, n=10) and G4 (unvaccinated unchallenged, n=8). Pigs were challenged with 4 x 10(4) VEG strain oocysts 57 days later. The G1 pigs produced high IgG antibody levels in the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) after the second dose of rhoptry vaccine, but were not clinically protected against a high dose oocyst challenge. Partial protection was observed in G1 at the chronic phase of infection, when compared with G3. Pigs in group 2 developed high antibody levels and were protected against clinic signs. T. gondii was not detected in two (G1) and three (G2) pigs by mouse bioassay. The results indicate partial protection in pigs vaccinated with a rhoptry vaccine.

Toxoplasmose ocular em cäes jovens inoculados com Toxoplasma gondii / Ocular toxoplasmosis in young dogs inoculated with Toxoplasma gondii

A toxoplasmose é uma doença zoonótica de distribuiçäo mundial que pode infectar uma grande variedade de espécies animais e o homem. No presente trabalho, foram avaliados nove cäes jovens inoculados experimentalmente com três cepas diferentes de T. gondii em que se observaram através de microscopia direta e indireta, alteraçöes oftálmicas em sete deles, confirmadas através de retinografia e histopatologia. Com os resultados obtidos, observou-se que as alteraçöes oftálmicas na toxoplasmose adquirida nos cäes apareceram já ao término da terceira semana pós-inoculaçäo, mostrando a precocidade das alteraçöes. No exame direto do olho, sete cäes apresentaram áreas de hiperrefletividade. Alteraçöes como papiledema, exsudato peripapilar e diminuiçäo da pigmentaçäo do tapetum foram observadas em três cäes submetidos à retinografia. O exame histopatológico revelou a presença de discreto infiltrado mononuclear na córnea na regiäo subepitelial em estroma conjuntivo em nível do ângulo da íris, congestäo vascular da coróide e edema sub-retiniano em oito cäes. Nossos resultados permitem concluir que a toxoplasmose ocular adquirida nos cäes é täo significativa quanto na espécie humana. Assim, estudos devem ser aprofundados nesta linha de pesquisa para reforçar os achados.

Diagnóstico em anaplasmose bovina / Diagnosis in bovine anaplasmosis

Anaplasma marginale (THEILER 1910) é uma rickettsia intra-eritrocitária obrigatória de ruminantes susceptíveis, transmitida biológica e mecanicamente por carrapatos e insetos hematófagos. Ela determina o aparecimento de formas clínicas aguda, superaguda, leve e/ou crônica, com um período pré-patente de 20 a 40 dias seguido por parasitemia e intensa anemia, provocando perdas com um custo estimado de 40 milhöes de dólares anuais; está amplamente distribuída nas regiöes tropicais, subtropicais e temperadas do mundo. A. marginale confere imunidade de origem humoral e celular que näo é dependente de infecçäo persistente. O diagnóstico é baseado em sinais clínicos, detecçäo do microorganismo no sangue, anticorpos no soro ou alteraçöes patológicas post mortem. O objetivo deste trabalho é reunir informaçöes sobre aspectos de diagnóstico da anaplasmose bovina.